domingo, 11 de marzo de 2012

práctica: 1 preparacion, fijación y coloracion simple

Práctica: 1

 
PREPARACION, FIJACION Y COLORACION SIMPLE DE FROTIS


Objetivo:

Aprender las técnicas de preparación de frotis, de fijación y de coloración mas utilizadas en el estudio microscópico de cultivos bacterianos, obtenidos de medios sólidos y líquidos. Identificar las principales formas bacterianas y la importancia de tinciones simples en la caracterización morfológica de estos microrganismos.

Introducción:

Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber.

Las bacterias se caracterizan por ser microorganismos unicelulares que carecen de membrana nuclear, en las cuales el material nuclear está organizado en una tira continua, a veces circular, contenido en el citoplasma, presentan un actividad metabólica y se dividen por fisión binaria, son organismos sofisticados y altamente adaptables a cambios del medio ambiente. Debido a su ubicuidad y su alta capacidad de adaptación su importancia en el campo medico como agentes causales de daño es altamente notable.

En tamaño y forma las bacterias de importancia médica son microorganismos muy pequeños que se presentan en tres formas generales: esféricos designados como cocos, organismos en forma de bastón designados como bacilos, y de formas espirilas, dentro de estas tres mencionadas anteriormente se encuentran otros microorganismos que adoptan variantes morfológicas designadas como formas pleomórficas.

Debido al pequeño tamaño de la mayoría de los microorganismos, se requiere de un microscopio óptico, ya sea de campo claro, en el que la observación de células vivas es limitada debido a que las células son incoloras y permiten el paso de una gran cantidad de luz. La observación de frotis teñidos es más recomendable. El frotis se prepara haciendo una extensión de los microorganismos sobre una superficie transparente, en la cual se fijan y se tiñen los microorganismos. De acuerdo al número de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se pueden realizar diferentes tipos de tinciones como lo son: simple, diferencial, negativa y selectiva. Los colorantes más utilizados son sales formadas por iones coloridos cargados conocidos como cromóforos. Por ejemplo:

Cloruro de azul de metileno à azul de metileno + Cl (cromóforo)

Si el cromóforo es un ion positivo el colorante es de tipo básico, pero si la carga es negativa será de tipo ácido. La mayoría de las bacterias son teñidas por colorantes básicos, que permean la pared celular y se adhieren por enlaces iónicos débiles a moléculas con cargas negativas de la célula bacterianas.


Reactivos:
·         Azul de metileno
·         Yodo lugol
·         Fenol
·         Aceite de inmersión
·         Agua destilada

Material:

·         5 portaobjetos

·         Piseta

·         Cuba

·         Microscopio

·         Asa de platino
Cultivos solidos demuestras seleccionadas:

·         Exudado vaginal

·         Uroanálisis

·         Faríngeo

Muestras biológicas:

·         Heces

·         Orina





Procedimiento:

1.      Se observaran las colonias de estos cultivos y se observara su morfología de sus colonias macroscópicamente.

Preparación de frotis:

2.      Lavar perfectamente portaobjetos, secarlos con papel y rotularlos dependiendo de la muestra que se colocara.

3.      Esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga rojo vivo.


4.      Centrifugar la orina y se decanta para obtener el sedimento.


5.      Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microrganismos sean destruidos. Después acercar al mechero el tubo de ensaye con el sedimento flamear rápidamente e introducir rápidamente y cuidadosamente el asa de platino.


6.      Colocar el sedimento en un porta objetos y este con una gota de agua destilada y diluir lentamente al final colocarle un cubreobjetos.


7.      Para los cultivos solidos colocar en el centro una gota de agua destilada en la que se mezcla una pequeña muestra del cultivo (colonia), extenderla suavemente y dejar secar al aire.


8.      Para la muestra de heces, colocar una gota de agua destilada en el centro del portaobjetos y con ayuda del asa de platino colocar una pequeña muestra de heces por lo regular donde exista sangre o moco, esta diluirla y colocarle una gota de yodo lugol al final colocarle un cubreobjetos.


Fijación de frotis:

1.      Los cultivos de los medios sólidos completamente secos se fijaran con calor. Para esto se pasara el frotis rápidamente  de 2 a 3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero.
2.      Palpar la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que no hubo sobrecalentamiento.


Tinción simple:

1.      Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto.


2.      Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de una piseta con agua.

3.      Dejar secar al aire.

Resultados:


40x: en esta imagen se encuentra un quiste de entamoeba
La muestra es de heces, el quiste se alcanza ver a las 11.


VISTA 100X: en esta imagen podemos apreciar la
Forma de unos cristales de la orina.



Vista 100x: en esta imagen igual podemos apreciar
Unos cristales estos de una forma abundante.

Vista 100x: en esta imagen podemos apreciar
Una hifa con unos nudillos. Esta es la muestra De un cultivo vaginal.

Conclusión:

Se entiende por tinción (o coloración) simple al teñido de los microorganismos aplicando sólo
Una solución colorante. Este tipo de tinciones pueden ser positivas o negativas.

Una tinción simple es una solución acuosa de un colorante básico único., el propósito general de esta tinción es destacar por completo el microorganismo completo para que se véanlas formas y las estructuras básicas. El colorante se aplica al extendido fijado durante un determinado tiempo y luego se lava y al final se seca. En ocasiones se agrega una sustancia química a la solución para intensificar la coloración, este aditivo se denomina mordiente.

El azul de metileno es el colorante más débil de los tres, razón por la cual se usa más concentrado y se deja actuar durante más tiempo. También a la solución de azul de metileno de uso se le agrega un álcali (KOH) como intensificante, que actúa haciendo más rápida e intensa la reacción de coloración. Generalmente como intensificante se usa un álcali para un colorante básico y un ácido para un colorante ácido. Debido a que el protoplasma bacteriano tiene una débil carga negativa que aumenta al aumentar el pH, se explica que en medios alcalinos las coloraciones de bacterias se hagan más intensas. La coloración positiva es la tinción de los microorganismos, efectuada con colorantes básicos que, como ya dijimos, poseen afinidad por los constituyentes celulares y se combinan químicamente con el citoplasma microbiano.en la coloración negativa los microorganismos q quedan sin teñir y se colorea el medio que los rodea. Por lo tanto, lo que se ve es el perfil de las células.

Observación:

Para hacer esta práctica en lo personal fue como una recapitulación de lo ya visto anteriormente en el lapso del curso, pero enfocándonos al título de nuestra practica primero para hacer cualquier técnica, estudio, etc., se debe tener una muestra del paciente, la tinción simple nos ayuda a ver la morfología de cualquier bacteria que se encuentra en ell cuerpo humano que nosotros mismos las tenemos pero algunas son patógenas y hay otras que son normales.

Referencia:

·         Bacteriología General: Principios Y Prácticas de Laboratorio

Escrito por Evelyn Rodríguez Cavallini, páginas: 51-55. Consultado el día: 07 de marzo de 2012.

·         Introducción a la microbiología


Escrito por Gerard J. Tortora,Berdell R. Funke,Christine L. Case. Paginas consultadas: 69-70 Consultado el día: 08 de marzo de 2012.     

·         http://www.monografias.com/trabajos15/tinciones/tinciones.shtm consultado el dia 10 de marzo

             consultado el dia 09 de marzo.