PREPARACION, FIJACION Y
COLORACION SIMPLE DE FROTIS
Objetivo:
Aprender las técnicas
de preparación de frotis, de fijación y de coloración mas utilizadas en el
estudio microscópico de cultivos bacterianos, obtenidos de medios sólidos y líquidos.
Identificar las principales formas bacterianas y la importancia de tinciones
simples en la caracterización morfológica de estos microrganismos.
Introducción:
Se denomina frotis a
la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con
objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen
agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida.
Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para
poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al
microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos
lavados. La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden
inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y
bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber.
Las bacterias se
caracterizan por ser microorganismos unicelulares que carecen de membrana
nuclear, en las cuales el material nuclear está organizado en una tira
continua, a veces circular, contenido en el citoplasma, presentan un actividad metabólica
y se dividen por fisión binaria, son organismos sofisticados y altamente
adaptables a cambios del medio ambiente. Debido a su ubicuidad y su alta capacidad
de adaptación su importancia en el campo medico como agentes causales de daño
es altamente notable.
En tamaño y forma las
bacterias de importancia médica son microorganismos muy pequeños que se
presentan en tres formas generales: esféricos designados como cocos, organismos
en forma de bastón designados como bacilos, y de formas espirilas, dentro de
estas tres mencionadas anteriormente se encuentran otros microorganismos que
adoptan variantes morfológicas designadas como formas pleomórficas.
Debido al pequeño
tamaño de la mayoría de los microorganismos, se requiere de un microscopio
óptico, ya sea de campo claro, en el que la observación de células vivas es
limitada debido a que las células son incoloras y permiten el paso de una gran
cantidad de luz. La observación de frotis teñidos es más recomendable. El frotis
se prepara haciendo una extensión de los microorganismos sobre una superficie
transparente, en la cual se fijan y se tiñen los microorganismos. De acuerdo al
número de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se pueden realizar
diferentes tipos de tinciones como lo son: simple, diferencial, negativa y
selectiva. Los colorantes más utilizados son sales formadas por iones coloridos
cargados conocidos como cromóforos. Por ejemplo:
Cloruro de
azul de metileno à azul de metileno + Cl (cromóforo)
Si el cromóforo es un
ion positivo el colorante es de tipo básico, pero si la carga es negativa será
de tipo ácido. La mayoría de las bacterias son teñidas por colorantes básicos,
que permean la pared celular y se adhieren por enlaces iónicos débiles a
moléculas con cargas negativas de la célula bacterianas.
Reactivos:
·
Azul de metileno
·
Yodo lugol
·
Fenol
·
Aceite de inmersión
·
Agua destilada
|
Material:
·
5
portaobjetos
·
Piseta
·
Cuba
·
Microscopio
·
Asa
de platino
Cultivos solidos demuestras seleccionadas:
·
Exudado
vaginal
·
Uroanálisis
·
Faríngeo
Muestras biológicas:
·
Heces
·
Orina
Procedimiento:
1. Se observaran las colonias de estos
cultivos y se observara su morfología de sus colonias macroscópicamente.
Preparación de frotis:
2.
Lavar perfectamente portaobjetos, secarlos con papel y rotularlos
dependiendo de la muestra que se colocara.
3. Esterilizar el asa en la flama del
mechero hasta que se ponga rojo vivo.
4. Centrifugar la orina y se decanta
para obtener el sedimento.
5.
Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los
microrganismos sean destruidos. Después acercar al mechero el tubo de ensaye
con el sedimento flamear rápidamente e introducir rápidamente y cuidadosamente
el asa de platino.
6.
Colocar el sedimento en un porta objetos y este con una gota de agua
destilada y diluir lentamente al final colocarle un cubreobjetos.
7. Para los cultivos solidos colocar en
el centro una gota de agua destilada en la que se mezcla una pequeña muestra
del cultivo (colonia), extenderla suavemente y dejar secar al aire.
8. Para la muestra de heces, colocar una
gota de agua destilada en el centro del portaobjetos y con ayuda del asa de
platino colocar una pequeña muestra de heces por lo regular donde exista sangre
o moco, esta diluirla y colocarle una gota de yodo lugol al final colocarle un
cubreobjetos.
Fijación de frotis:
1. Los cultivos de los medios sólidos
completamente secos se fijaran con calor. Para esto se pasara el frotis
rápidamente de 2 a 3 veces en el
interior de la parte amarilla de la flama del mechero.
2.
Palpar
la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano izquierda para
enfriar y comprobar que no hubo sobrecalentamiento.
Tinción simple:
1. Cubrir el frotis con 2 gotas de azul
de metileno durante 30 segundos a 1 minuto.
2.
Eliminar
el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de una
piseta con agua.
3.
Dejar
secar al aire.
Resultados:
La muestra
es de heces, el quiste se alcanza ver a las 11.
Forma de
unos cristales de la orina.
Vista 100x: en esta imagen igual podemos apreciar
Unos
cristales estos de una forma abundante.
Vista 100x: en esta imagen podemos apreciar
Una hifa con
unos nudillos. Esta es la muestra De un cultivo vaginal.
Conclusión:
Se
entiende por tinción (o coloración) simple al teñido de los microorganismos
aplicando sólo
Una solución colorante. Este tipo de
tinciones pueden ser positivas o
negativas.
Una tinción simple es
una solución acuosa de un colorante básico único., el propósito general de esta
tinción es destacar por completo el microorganismo completo para que se véanlas
formas y las estructuras básicas. El colorante se aplica al extendido fijado
durante un determinado tiempo y luego se lava y al final se seca. En ocasiones
se agrega una sustancia química a la solución para intensificar la coloración,
este aditivo se denomina mordiente.
El
azul de metileno es el colorante más débil de los tres, razón por la cual se
usa más concentrado y se deja actuar durante más tiempo. También a la solución
de azul de metileno de uso se le agrega un álcali (KOH) como intensificante, que
actúa haciendo más rápida e intensa la reacción de coloración. Generalmente
como intensificante se usa un álcali para un colorante básico y un ácido para
un colorante ácido. Debido a que el protoplasma bacteriano tiene una débil
carga negativa que aumenta al aumentar el pH, se explica que en medios alcalinos
las coloraciones de bacterias se hagan más intensas. La coloración positiva es
la tinción de los microorganismos, efectuada con colorantes básicos que, como
ya dijimos, poseen afinidad por los constituyentes celulares y se combinan
químicamente con el citoplasma microbiano.en la coloración negativa los
microorganismos q quedan sin teñir y se colorea el medio que los rodea. Por lo
tanto, lo que se ve es el perfil de las células.
Observación:
Para hacer esta práctica
en lo personal fue como una recapitulación de lo ya visto anteriormente en el
lapso del curso, pero enfocándonos al título de nuestra practica primero para
hacer cualquier técnica, estudio, etc., se debe tener una muestra del paciente,
la tinción simple nos ayuda a ver la morfología de cualquier bacteria que se
encuentra en ell cuerpo humano que nosotros mismos las tenemos pero algunas son
patógenas y hay otras que son normales.
Referencia:
·
Bacteriología General: Principios
Y Prácticas de Laboratorio
Escrito por Evelyn Rodríguez Cavallini, páginas: 51-55. Consultado el día: 07 de marzo de 2012.
·
Introducción a la microbiología
Escrito por Gerard J. Tortora,Berdell R.
Funke,Christine L. Case. Paginas
consultadas: 69-70 Consultado el
día: 08 de marzo de 2012.
·
http://www.monografias.com/trabajos15/tinciones/tinciones.shtm consultado el dia 10 de marzo
consultado el dia 09 de marzo.