martes, 10 de abril de 2012

práctica 2: preparación y esterilizacion de materiales y medios de cultivo


Práctica: 2


PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y DE MEDIOS DE CULTIVO


Objetivo:

Aprender los medios de cultivos básicos que existen en laboratorio al igual para que medio de efectúa cada uno (aplicaciones), aprendiendo claramente que para tener un crecimiento de colonias debemos esterilizar el material ya que debe ser realista el antígeno que se va a estudiar ya que de este se deriva el diagnostico clínico.


Introducción:

La esterilización se define como la destrucción completa de todos los microorganismos presentes incluyendo las formas vegetativas y las esporas. Para lograr la destrucción de las bacterias, existen diferentes medios como son: la acción de los agentes químicos y antibióticos. 

Los principales métodos de esterilización empleados en el laboratorio de bacteriología son:

Calor húmedo, seco, y filtración para los líquidos sin olvidar que cuando se requiere una esterilización mas completa se efectúa esta usando gas (oxido de etileno) y el área de trabajo se expone a los rayos ultravioleta.

Los microorganismos estudiados en el laboratorio por lo regular son heterótrofos, ya que requieren de compuestos complejos como fuentes de carbono y nitrógeno.

Los microorganismos como otros seres vivos son susceptibles a los cambios de temperatura a medida que se han podido a adaptar a estos cambios.

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es  observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales paradas en el laboratorio.

El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado,  así como un grado correcto de acidez o alcalinidad.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo.

La materia prima que se utiliza para estos medios son:

PEPTONAS.- son moléculas que se obtienen de la degradación de las proteínas de origen vegetal o animal las que presentan una fuente de nitrógeno en forma de proteínas digeridas que son fácilmente asimilables por los microorganismos en crecimiento.

HIDROCARBUROS.- se utilizan como fuente energética y permite ver reacciones del metabolismo de los microorganismos (bioquímicas).

SALES.- como el cloruro de sodio, mantiene la isotonicidad y forma soluciones amortiguadoras (mantiene el equilibrio osmótico).

AGAR.- es un polisacárido obtenido de las algas rodofíceas y proporciona un soporte al medio de cultivo ya que es una agente solidificante.

CALDO NUTRITIVO O BASE.- Es un medio básico a partir del cual se preparan otros muchos e importantes medios, es un caldo elaborado con extracto de carne, contiene además substancias extractivas solubles, sales y algo de carbohidratos (dextrosa); pero poca proteína, la peptona que se agrega satisface la cantidad de proteínas necesarias, la sal que se añade es para dar al caldo el mismo contenido aproximado que tiene la sangre. A este medio se le puede agregar sangre entera estéril la que enriquece al medio.


USOS: se emplea en cultivos primarios y en análisis de agua y además según los ingredientes que se le agreguen sirve para gran variedad de propósitos, ejemplo: estudio del metabolismo bacteriano.  


Reactivos:
·         Agua destilada
·         Colorantes de Gram
·         fenol

Material:


·         Portaobjetos

·         Matraz Erlenmeyer

·         Cajas Petri

·         Algodón, gasa, papel estraza

·         Cinta testigo  

·         Piseta

·         Cuba

·         Microscopio

·         Autoclave

·         Incubadora

·         Asa de platino

·         tripie

·         Mechero de bunsen y Fisher



Agares seleccionados en solución de 40 mL:

·         SS (salmonella y shigella)

·         EMB

Muestras biológicas:

·         Heces

·         Orina

·         Mucosidad vaginal

·         Mucosidad faringea

Procedimiento:

1.      Lavar perfectamente dos matraces con escobillón y detergente. Enjuagar con abundante agua corriente.


2.      Pesar con ayuda de una balanza la cantidad necesaria de medio de cultivo de agar EMB y S.S. para una solución de 40 ml de agua. SS: 2.9 gr. EMB: 1.49gr.


3.      Elaborar con algodón y gasa unos tapones para los matraces, que ajuste en estos, sobre estos colocar un gorrito hecho con estraza.

4.      En un matraz agregar 40ml de agua purificada.


5.      Limpiar el área de trabajo con fenol para desinfectarla. Encender el mechero de Bunsen, y colocar sobre este el tripie y encima la tela de asbesto.

6.      Agregar el agar cual sea de los ya mencionados anteriormente al matraz, colocar este último sobre la tela de asbesto y disolver calentado. Dejarlo hervir durante un minuto.


7.      Cuando se alcance el punto de ebullición, bajar el matraz del fuego, flamear el tapón y la boca del matraz, para taparlo y colocarle el papel estraza. Repetir los pasos 5-8 para el siguiente medio.



8.      Colocar las cajas de Petri cerca del mechero, y verter en una de ellas el medio S.S. hasta la ¾ partes. Esperar a que solidifique.

9.      Esterilizar con autoclave solamente al medio EMB, de la siguiente manera:


·         En la olla exprés verter agua hasta el nivel indicado (1/3 parte)

·         Colocar la base dentro de esta y ponerla al fuego (con los mecheros Fisher)


·         Meter los medios a la autoclave.


·         Cerrar la olla y esperar a que la temperatura se eleve


·         Dejar que se caliente hasta los 121°C o 15 libras de presión revisando continuamente la escala del manómetro. Una vez alcanzada esta temperatura deberá bajarse el nivel del fuego sacando y metiendo uno de los mecheros.


·         Mantener así por 15 minutos.


·         Transcurridos los 15 minutos. Apagar el fuego y dejar a que la presión descienda a 0.

·         Abrir cuidadosamente la olla y sacar los medios ya esterilizados.


10.  Dejar enfriar al medio, hasta una temperatura en la que el matraz caliente pero no queme la piel, y verter suavemente en la caja o cajas Petri el medio de cultivo.


11.  Una vez que se tienen solidificados los medios de cultivo, se procede a sembrar en ellos. Se toma el asa, se flamea y se toma un poco de la muestra de heces, para hacer el rayado de la placa en sectores, sembrando en ambos medios. Se flamea nuevamente el asa y se procede a la misma operación pero con la orina.


Se dejan incubar en la estufa de incubación por un lapso de 24-48 horas




Preparación de frotis:

1.       Tiempo transcurrido. Se sacan los medios de cultivo y se observan las colonias de estos microorganismos estas se observan macroscópica como microscópicamente.




2.       Lavar y secar perfectamente los portaobjetos.

3.       Limpiar la mesa o lugar de trabajo con fenol.

4.       Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo.


5.       Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos.


6.       Colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extender suavemente en un área circular de 2 cm de diámetro aproximadamente o colocar en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada en la que se mezcla una pequeña muestra del cultivo y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis al aire


7.       Fijar los frotis


8.       Teñir por tinción de Gram (cristal violeta 1min).


9.       Yodo lugol 1min. Enjuagar con alcohol cetona.


10.   Poner safranina 1min. Y enjuagar con agua corriente.


11.   Dejar secar al aire y observar la preparación al microscopio localizando con el objetivo 10x, pasar luego a 40x y observar a detalle con el objetivo 100x, colocando previamente una gota de aceite de inmersión.


Resultados:

Medio S.S.


Cuando se preparó este medio y se vacío a las cajas

Petri su consistencia se pudo notar un poco de color rosa

Claro con estado sólido.



Medio S.S (colonias)


En este medio se sembro mucosidad vaginal y he aquí

Los resultados de sus colonias estas se pueden observar

·         Puntiforme

·         Lisa

·         Elevada

Con un estado mucoide.



Vista microscópicamente agar S.S



Se observan estreptococos gramnegativos.



Medio EMB


En la reparación de este medio notábamos que su color

Era un poco verdoso pero a la vez con un color violeta.


Medio EMB (colonias)


En este medio se sembró mucosidad faríngea

Sus colonias no eran muy notorias ya que viéndolas

Macroscópicamente algunos se podían ver blanquecinos

Mucoides, puntiformes, planas con un borde ondulado.



Vista microscópicamente de agar EMB

Tinción diferencial


En esta podemos observar demasiados bacilos

Con agrupaciones empalizados gramnegativos.



Observación:

Al hacer esta practica se pudo hacer practica de conocimientos ya vistos previamente para hablar un  poco de todo para hacer el estudio del comportamiento, como yo digo la personalidad de la bacteria invitro  primero se debe hacer una esterilización de material para efectuarse bien y para que no exista una contaminación y observemos de otro microorganismo, se hace el medio de el procedimieto que se necesite este. Cultivamos o sembramos el microorganismo de alguna muestra biológica que se necesite diagnosticar algo dependiendo de que cuadro clínico se sospeche por ejemplo: si se sospecha de E.coli la muestra necesaria seria de heces fecales en un medio EMB ya que este esta enriquecido para que esta batería se pueda desarrollar esta bacteria al igual que se pueda identificar macroscópicamente y por lo tanto para hacer la identificación microscópica se hace una tinción, en este caso nosotros hicimos una de gram esta se basa en diferenciar las bacterias ya que se clasifican en negativas y positvas al igual se estudia las agrupaciones, y morfología.



Conclusión:

El medio SS nos sirve para el aislamiento de salmonellas y de Shigella de heces, de comestibles y de otros materiales.

Las enterobacterias pueden ser diferenciadas en base a su capacidad de fermentar la lactosa . Las especies de Salmonella y Shigella son no fermentadoras de la lactosa y forman colonias incoloras en el Agar SS. Las especies de Salmonella que son productoras de sulfuro de hidrógeno desarrollan colonias con centro obscuro.

Los coloformes son parcialmente inhibidos. E. Coli produce colonias de color rosa a rojo y pueden presentar una zona de precipitado. Las colonias de Enterobacter aerogenes son cremosas de color rosa. Citrobacter y Proteus spp. Pueden crecer produciendo colonias con centros de color gris o negro debido a la producción de H2 S. Enterobacter faecalis es parcialmente inhibido presentando colonias incoloras.

El medio EMB nos sirve para Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.


Referencia:

·         Diagnostico microbiológico-koneman/Allen/Janda/Sommers/Winn-editorial medica panamericana.

·         Métodos de labortaorio-M.J.Linch-nueva editorial interamericana.



No hay comentarios:

Publicar un comentario en la entrada